Mediante la utilización de la CLAR se han desarrollado diferentes métodos de separación, ya sea con el empleo de fases estacionarias quirales, adición de aditivos quirales a la fase móvil por ejemplo contraiones, o por derivatizaciones para llegar a la formación de diastereoisómeros que luego puedan ser separados con la utilización de una columna cromatográfica aquiral. El primer método encontrado fue el empleado por Haginaka y otros14 en un estudio de enantioselectividad y orden de elución enantiomérica del racemato de propanolol y sus ésteres derivados: o-acetil, -propionil, butiril, -valeril acetonitrilo, el flujo se mantuvo a 1 mL/min. Se determinó que la enantioselectividad depende del pH de elución y del modificador orgánico utilizado .La inversión del orden de elución de los enantiómeros del racemato de propanolol y sus ésteres derivados ocurrió en un rango de pH entre 5 y 7 y/ o por variación del modificador orgánico. Tomando en cuenta que el valor de pka del propanolol es de 9,45, este compuesto y sus ésteres son protonados a un valor de pH por encima del rango de elución estudiado; por tanto, al valor de pH entre 5-7 cuando ocurre la inversión del orden de elución de los enantiómeros, la OVM se carga negativamente por causa de su punto isoeléctrico, que se encuentra entre 3,8 y 4,3.
Esteres del propanolol HCl:
Este mismo método fue empleado por Ikeda y Hamasaki, 15 para la separación de varios medicamentos enantioméricos, pero utilizaron como fase estacionaria quiral celulosa tris-(3,5-dimetilfenilcarbamato) en una columna Chiralcel OD (25 cm x 4,6 mm). La fase móvil empleada fue perclorato de sodio (0,05 mol/L)/ acetonitrilo (7:3), con un flujo de 1 mL/min para el caso específico del medicamento propanolol.
Otro tipo de columna quiral como la -AGP (10 cm x 4 mm) fue empleada para la separación de los enantiómeros del propanolol por Haupt y otros, 16 quienes utilizaron como fase móvil buffer de ácido fosfórico (1 mol/L) / hidróxido de sodio (1mol/L) y como modificadores Tween 20 y ácido heptanoico, ajustado para una fuerza iónica de 0,1 y a un valor de pH entre 4,5- 6,5; el flujo empleado fue de 0,9 mL/min
y detección a 250 ó 280 nm. Una columna similar utilizaron
Enquist y Hermansson, 17 para la separación de los enantiómeros de agentes ß-bloqueadores, pero como fase móvil emplearon buffer fosfato que contenía diferentes concentraciones de modificadores no cargados, N,Ndimetiloctilamina (DMOA) o (-)- terodilina. La concentración de buffer fosfato fue 0,01 mol/L en esta fase móvil y 0,02 mol/L en las fases que contenían modificadores cargados. El pH se ajustó a 7,2 con NaOH y un flujo de 0,9 mL/min, y la detección entre 300 y 400 nm (excitación a 295 nm). La enantioselectividad se optimizó cuando se añadió un aditivo en la fase móvil. Erdensson y otros18 combinaron la utilización de la columna quiral con la derivatización del analito para realizar la separación de ß-bloqueadores enantioméricos, ya que éstos son separados en una columna de silicagel enlazada a ácido a - 1-gli-coproteína (3 cm x 3,0 mm), después de ser convertidos en derivados de oxazolidinona por reacción con solución de fosgeno al 20% en tolueno. La fase móvil utilizada fue buffer fosfato de pH=7,0/ /propan-2-ol (de 4 hasta 15 %), a una velocidad de flujo de 0,5 mL/min y detección a 215 nm. El empleo de aditivos quirales en la fase móvil también aportó buenos resultados a Pettersson y otros19 cuando emplearon el contraión N-benziloxicarbonilglicil-L-prolina (ZPG), el cual fue añadido a la fase orgánica para la separación directa de los enantiómeros no derivatizados de amino-alcoholes, así como algunos agentes ß-bloqueadores adrenérgicos. La separación se realizó en una columna LiChrosorb Diol (15 cm x 3 mm) y como fase móvil utilizaron
diclorometano saturado en agua con ZPG (25 mmol/L) y trietilamina (0,2 mmol/L), y detección ultravioleta. La estereoselectividad fue alta para alprenolol, metoprolol y propanolol. Los autores plantean que el contraión contiene un grupo carboxilo que brinda energía electrostática o asociación a complejos mediante enlaces por puente de hidrógeno (pares-iónicos) con aminas en solventes orgánico. La ZPG también tiene una función carbamato y una amida que pueden dar interacciones adicionales, como por ejemplo los enlaces de hidrógeno con grupos hidroxilos en aminoalcoholes, por lo que es posible una interacción por varios puntos. Además reviste gran importancia la distancia de enlace en la selectividad quiral y ésta se pierde cuando el hidroxilo se encuentra en una posición alejada del grupo amino.
La adición de una amina a la fase móvil (por ejemplo trietilamina) provoca la competencia de ésta con los aminoalcoholes enantioméricos por la formación del par-iónico con ZPG, y además compite por la limitada capacidad de adsorción de la fase estacionaria.
Otro contraión empleado fue el ácido d-10-camforsulfónico por Gupta y otros 20 para la separación de los enantiómeros del propanolol por CLAR en columna Zorbax- CN (25 cm x 9,5 mm). La fase móvil de baja polaridad contenía al contraión quiral y la ter- -butilamina como base en diclorometano/ /hexano/acetonitrilo (79:20:1) y detectado a 280 nm.Los resultados de la investigación demostraron que la resolución aumenta cuando se realiza una recirculación de la fase móvil con las mezclas a separar.
La derivatización del propanolol con (+)-1-(9-fluorenyl) etilcloroformato también fue empleada para lograr la separación quiral y el mejoramiento de la detección, después se efectuó una técnica de CLAR en columna MicroPac SP C8 (15 cm x 4 mm), como fase móvil acetato de sodio / acetonitrilo (3:7) a un flujo de 2mL/min y detección fluorescente a 345 nm (excitación a 265 nm) o detección UV a 254 nm. Cuando se realizó la detección por fluorescencia se detectaron interferencias que fueron eliminadas por absorbancia UV.21
Sin embargo, Mulder y Conemans22 experimentaron la derivatización con isocianato de 2, 3, 4,6-tetra-O-acetil-ß-Dglucopiranosil, después de realizar una extracción en suero con diclorometano. Los derivados D y L- -propanolol fueron separados por CLAR en columnas Spherisorb ODS, se utilizó dihidrogenofosfato de amonio (0,02 mol/L) acetonitrilo (21:29) como fase móvil y detección a 230 nm. Un estudio similar fue realizado por otros autores, donde los enantiómeros del propanolol y 10 compuestos relacionados fueron separados por formación de derivados similares al experimento anterior o con isotiocianato de 2,3,4-tri-O-acetil-alfa-Darabinopiranosil.Posteriormente se les realizó una técnica por CLAR en columna Ultrasphere ODS (15 cm x 4,6 mm), con elución isocrática desde 37 hasta 75 % de acetonitrilo en fosfato de amonio (0,02 mol/L).
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